[摘要] 目的 建立六味地黄滴心丸总糖含量测定方法。 方法 以蒽酮-硫酸比色法，检测波长为625 nm，用葡萄糖为对照品对六味地黄滴心丸中总糖的含量进行测定。 结果 葡萄糖对照品溶液的线性范围为0.005 4～0.026 8 mg/mL（r = 0.999 8），平均回收率为98.30％。 结论 本研究确定的方法简便，可靠，准确，可用于六味地黄滴心丸中总糖的含量测定。
[关键词] 六味地黄滴心丸；总糖；蒽酮-硫酸法
[中图分类号] R286.0[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）03（c）-0098-03
The determination of total polysaccharides in Liuwei Dihuang Dropping Core Pills
YAN Hui1 YANG Lihong2 WANG Suhui1 ZHANG Ruishu3
1.Department of Pharmacy, the General Hospital of Beijing Millitry Region, Beijing 100700, China; 2.Supply Station for Drug and Instrument, Beijing Millitry Region, Beijing 100700, China; 3.The Outpatient Department of Beijing Military Command, Beijing 100144, China
[Abstract] Objective To establish the ultraviolet method for the determination of total polysaccharides in Liuwei Dihuang Dropping Core Pills. Methods Determination of total polysaccharide in Liuwei Dihuang Dropping Core Pills was carried out by anthrone-sulfuric acid colorimetric method with glucose as the standard at the wavelength of 625 nm. Results Calibration curve showed good linear regression (r = 0.999 8) with the range of 0.005 4-0.026 8 mg/mL. The average recovery was 98.30%. Conclusion The method in research is simple, reliable, accurate and can be used to determination of total polysaccharides in Liuwei Dihuang Dropping Core Pills.
[Key words] Liuwei Dihuang Dropping Core Pills; Total polysaccharides; Anthrone-sulfuric acid colorimetric metho
六味地黄滴心丸是六味地黄丸的改进剂型，六味地黄是补肾经典名方，具有滋补肾阴之功效，常用于治疗肾阴不足之证。六味地黄由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮及茯苓六味中药组成，其每一味药材中都含有多糖[1-6]。近年研究表明，多糖是其免疫促进作用的主要有效成分之一，相对分子量为3万左右[7]。为此，笔者认为对多糖进行含量测定有利于保证六味地黄制剂的质量。但因多糖组成复杂，得到对照品较困难，目前多采用单糖如葡萄糖测定样品中多糖的相对含量，且由于多糖本身无法直接测定，只有水解为葡萄糖后才能测定。为准确起见，本研究定为测定其总糖含量，并进行方法学考察，现报道如下：
1 仪器与试药
1.1 仪器
TU-1201型紫外分光光度计（北京市通用仪器设备公司）；AY220型SHIMADZ托盘分析天平（日本岛津公司）。
1.2 试药
六味地黄滴心丸（北京军区总医院制剂中心生产，批号：090115、090116、090117）；无水葡萄糖对照品（批号：110833-200302）；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
参照有关文献，总糖含量测定采用蒽酮-硫酸比色法[8-9]，照紫外-可见分光光度法[10]测定。
2.1 供试品溶液的制备
取六味地黄滴心丸20丸，研细，取1 g，精密称定，加水100 mL回流提取2次，每次1 h，滤过（用热水洗涤残渣），合并滤液，浓缩，转移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取2 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，定容，摇匀，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取无水葡萄糖对照品6.25 mg，加纯化水于25 mL量瓶中，制成每1 mL含0.25 mg的溶液，溶解，定容，摇匀，即得。
2.3 空白对照溶液的制备
按剂型原辅料的配制比例，精密称取变性淀粉适量，加水制成空白对照溶液即得。
2.4 蒽酮-硫酸试液的制备
称取蒽酮0.5 g溶于2 mL乙酸乙酯中，振摇溶解，加入80%硫酸溶液至250 mL，充分振摇溶解，置棕色瓶中密塞备用。
2.5 测定波长的选择
精密吸取对照品溶液1.0 mL，供试品溶液1.0 mL，分别置干燥具塞试管中，以纯化水1.0 mL作空白对照；每管分别加纯化水至2.0 mL，再分别精密加入0.2%蒽酮-硫酸试液4.0 mL。立即摇匀，放冷至室温，显色后，用紫外分光光度计于400～800 nm范围扫描，结果对照品溶液、供试品溶液显色后扫描图谱基本相似，均在625 nm左右有最大吸收，空白对照溶液无吸收，故选择625 nm作为样品的测定波长。见图1。
2.6 标准曲线的绘制
精密吸取对照品溶液（0.268 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，各加水至2.0 mL，再加0.2%蒽酮-硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，放冷至室温。以试剂为空白，在625 nm处测定其吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y = 32.257X＋0.001 7，r ＝ 0.999 8。结果表明葡萄糖浓度在0.005 4～0.026 8 mg/mL范围内，呈良好的线性关系。见图2。
2.7 测定方法
精密吸取样品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，照“2.6”项下标准曲线的制备进行，自“加水至2.0 mL”起操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中总糖的含量，计算，即得。
2.8 精密度试验
取标准曲线试验项下的对照品溶液，按“2.7”项下测定方法，重复测定6次。见表1。
2.9 稳定性试验
取供试品溶液，按“2.7”项下测定方法，分别于0、30、60、90、120 min测定吸光度，结果供试品溶液在120 min内基本稳定。见表2。
2.10 重复性试验
取六味地黄滴心丸样品，按“2.7”项下测定方法，重复测定6份。见表3。
2.11 准确度试验（即回收率试验）
采用加样回收率试验，取已知含量的样品6份，分别加入无水葡萄糖对照品200 mg，按“2.7”项下测定方法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中总糖的含量，计算回收率。见表4。
2.12 含量测定
取六味地黄滴心丸，按“2.1”供试品溶液的制备方法制备样品溶液，按“2.7”项下测定方法，测定3批样品。见表5。
3 讨论
多糖含量的测定方法有苯酚-硫酸法、地衣酚-硫酸法、Somogyi-Nelson法、蒽酮-硫酸法等[11]。其中苯酚-硫酸法是常用测定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖等的测定，方法简单，准确性较好，灵敏度高，适用面较广，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定160 min以上[7-9]，但其亦存在缺陷，因苯酚易氧化，见光或遇氧即逐渐氧化成淡红色，在测定中须避光或操作迅速，只有在稳定和熟练的操作情况下才能获得理想的重现性。
本实验采用蒽酮-硫酸法，原理是糖类在硫酸作用下脱水生成糖醛或其衍生物后，与蒽酮试剂迅速而完全地缩合成稳定的蓝绿色糖醛衍生物，其生成量与多糖含量存在定量关系，灵敏度高且快速。蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。因此，蒽酮-硫酸法测定结果可能偏高[9]，但蒽酮试剂较稳定，且试液在120 min内显色稳定，重现性好，该方法可以作为六味地黄滴心丸中多糖含量测定的方法。
实验过程中，在使用硫酸-蒽酮显色剂时，由于蒽酮见光易分解，因此，蒽酮-硫酸溶液必须现用现配。另外，样品测定时，试管中加入蒽酮-硫酸溶液后，由于放热反应试管温度急剧升高，试管可用自来水冲洗冷却。
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（收稿日期：2011-11-11本文编辑：卫 轲）