[摘要] 目的 研究血管内皮生长因VEGF在肾癌细胞中的表达，检测对肾肿瘤的影响。 方法 将针对血管内皮生长因子的RNA的模板区的siRNA转导肾癌细胞786-0中，采用免疫组化检测血管内皮因子VEGF的蛋白的表达，通过siRNA对血管内皮生长因子的抑制，减少肿瘤中血管的生成，从而抑制小鼠肿瘤的生长。 结果 通过siRNA对肾癌血管内的血管内皮生长因子的干扰，抑制了肿瘤血管的生长，减慢了肿瘤的生长速度。 结论 siRNA抑制血管内皮生长因子的表达，能明显减慢肿瘤的生长速度；肿瘤的生长速度与VEGF过度表达有关。
[关键词] 血管内皮生长因子；肾肿瘤；小鼠肿瘤体积
[中图分类号] R737.11[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）03（c）-0022-03
Experimental research of VEGF-siRNA in renal carcinoma
SUI Yudong WANG Xiaomin▲ YANG Dejun WANG Keliang
Department of Urinary Surgery, the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang Province, Harbin 150001, China
[Abstract] Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal carcinoma cell, detect the influence to renal carcinoma. Methods siRNA contraposed RNA of VEGF in template area was transducted in 786-0 of renal carcinoma cell, detected albumen expression of VEGF adopt immunohistochemistry, reduced angiogenesis in tumour through inhibiting VEGF by siRNA, inhibited tumor growth of mouse. Results Through obstructing VEGF in artery of renal carcinoma by siRNA, tumor vessel growth had been inhibited, the velocity of tumor vessel growth had been revved down. Conclusion siRNA can inhibit the expression of VEGF, down the velocity of tumor vessel growth which has relation with overexpression of VEGF.
[Key words] Vascular endothelial growth factor; Renal tumor; Gross tumor volume of mouse
肾癌是泌尿系统中最常见的肿瘤，在治疗上通常采用的是手术治疗，但是在早期诊断时有大约30%的患者存在转移的现象，其转移的主要方式是血道转移和淋巴道转移[1]。肿瘤的转移是涉及很多因子的复杂过程，研究发现有很多因子参与转移过程，最值得关注的是血管内皮生长因子VEGF，其是通过旁分泌的方式释放，从而刺激肿瘤血管的生成，加快肿瘤的生长，VEGF不仅加快血管生长速度，也增加血管的通透性，Ferrara 等[2]报道中提及肾癌的肿瘤的生长是通过自分泌和有通透性的作用。为了减少肾癌的远处转移和抑制肿瘤的生长速度，采用了对siRNA和血管内皮生长因子的研究，探讨肾癌的治疗前景。
1 材料与方法
1.1 实验体外过程
1.1.1 实验材料肾癌细胞786-0由实验室自身提供，siRNA的设计：在Gene Bank查找编码人VEGF cDNA的序列，应用Ambion公司RNAi设计软件并参考有关文献，进行全基因组扫描和序列同源分析，设计针对VEGF mRNA不同剪接子的RNAi作用的公共靶点，上述由广东锐博合成所需的编码RNA，然后由该公司转导质粒中。
1.1.2 方法siRNA的合成：广东锐博根据提供参考的碱基对5′-ＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡ-3′（有义链）；3′
-ＧＴＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＡ
ＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡ-5′，合成目的siRNA。
1.1.3 质粒的转导和提取由广东锐博根据碱基序列合成所需的质粒，并由广东锐博将质粒转导大肠杆菌中，再放进摇箱进行摇晃，观察甘油菌的生长情况，同时加氨苄西林将非耐药的大肠杆菌杀死，使其含目的质粒的基因在大肠杆菌内大量繁殖。然后将质粒提取检测质粒，加入甘油进行保存。
1.1.4 培养细胞将实验室提供的肾癌786-0细胞系放置于人工培养液血清1640中，每24小时更换培养液，置于37℃温箱中进行繁殖、传代，冻存以备后期使用。
1.1.5 细胞分组和转染细胞将培养的肾癌细胞进行分组，分为空白组、目的组、含空质粒组、其他干扰因子组四组，转染前24 h，进行细胞准备，实验前24 h接种细胞，每孔细胞0.8×105个，密度为50%，第2天细胞密度增加至75%左右时，进行细胞转染。
1.1.6 检验转染是否成功将转染后的细胞进行传代繁殖，挑选状态好的细胞进行荧光下显像，观察细胞的形态以及分析是否转染成功，也可以通过RT-PCR技术检测是否转染成功。在图1中可以看出转染后的肾癌细胞呈现梭形，在荧光显微镜下能够看出荧光梭行肾癌细胞，结构完好，荧光显色均匀，未见肾癌细胞的破裂，转染成功。
1.1.7 WESTER-BLOT此步骤是为了检验蛋白产生，具体步骤如下：①先将细胞在超声下均浆破碎；②加入1.5 mL的裂解液，震荡混匀，冰上孵育30 min，离心，将上清液弃去，加入Nonidet P40至浓度0.6%，摇匀，冰上孵育10 min，将沉淀悬浮于0.5 mL的loading buffer 中，样品在冰上孵育30 min，2 000 r/min，4℃下离心10 min，将沉淀的蛋白分装，保存。将等量蛋白样品经10% SDS-J聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以湿转法移到NC膜上，转移缓冲液转移条件为电流1 A，将时间调制1 h，转移后的NC膜经3% BSA室温封闭3 h，加入适当稀释的一抗，在4℃下过夜，用洗涤液buffer洗膜3遍，加入相应的二抗，在37℃下反应2 h，洗膜，以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。在图2中能够清楚看见，在蛋白电泳中出现蛋白条带阳性，间接表示转染后的肾癌细胞中有转染后VEGF蛋白表达。
1.1.8 细胞生长曲线将肾癌细胞786-0制成细胞悬液接种于96孔板上，每孔浓度1×107/L，24 h后更换培养液，同时加入不同浓度的siRNA，每隔24 h取3孔做细胞计数，取平均值。
1.1.9 CCK-8法很多实验应用MTT方法，但是CCK-8在实验中具有简便、安全、精确的优点。步骤：接种细胞悬液于96孔板内，经37℃、5% CO2培养箱培养至细胞贴壁，再分别加入不同浓度的Ki67 siRNA,，每一浓度做3个复孔，并以negative siRNA和空白做对照，37℃下5% CO2培养箱培养72 h，有另外几孔已知数量的活细胞以备制标准曲线。将CCK-8试剂解冻，每孔加入10 μL，注意不能有气泡，放置培养箱4 h。用酶标仪检测在450 nm波长的吸光度，参照对照比630 nm波长。根据公式抑制率=（1-实验组A值/阴性对照A值）×100%计算抑制率。
1.2 体内实验部分
1.2.1 小鼠分组动物实验模型的建立与分组：给予正常的18只小鼠正常喂养，然后将小鼠标有数字，写在卡片上，放在暗箱中随机分组，将其分为3组，分别是目的组（VEGF），绿色荧光组（GPF），空质粒组（Control），每组6只小鼠，将小鼠进行同样饮食饲养，饲养天数为21 d。然后将体外培养好的带有目的基因的肾癌细胞，配制密度1.0×107个/mL，在每只小鼠的背部皮下注射细胞悬液约0.3 mL，然后正常喂养小鼠，其他两组依次按此法喂养。
1.2.2 计算测量肿瘤大小观察瘤体体积：在正常饲养小鼠的情况下，每隔1 d用卡尺测量最大直径的长度A和与之垂直的最大宽径B，利用公式得出相应结果，比较各组小鼠的生长情况，绘制肿瘤的生长曲线。
1.2.3 测量血管密度病理形态观察和免疫组化检测VEGF表达、血管密度。在实验结束后处死小鼠，取出肿瘤组织，应用常规HE染色，观察组织变化，用兔抗鼠VEGF作为一抗，按照说明进行SABC法免疫组织化学染色，随机在肿瘤的边缘与正常组织取平均值MVD，计算与同视野下的肿瘤细胞总数均值的比值，作为肿瘤细胞VEGF的表达阳性率MVD技术按Weidner评价标准进行。
1.3 统计学方法
利用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多个样本之间均数比较采用方差分析，以P